美术史学家詹森从美学角度指出，这一种神秘微笑的造成是因为作者力图要在一个个性非常具体的人物身上，创造出他理想化了的美的典型，力图要使一闪即逝的面部表情，象征永恒的喜悦。正是这种矛盾的结合造就了不朽的艺术魅力。还有一些人从绘画技巧研究画像，说达芬奇为这个坐在阳台上的少女设置了一幅透视不一的背景：当人们的视线集中在左边，感到远景下降而人物上升；反之，当人们到右边看时，觉得远景上升而人物下降。画像中的人物五官，其位置亦在游移不定之中。加上作者把体现人的笑容的嘴角、眼角部位又画得模模糊糊，使画中主人公的笑令人百思不得其解。甚至一些人从医学的角度出发，别出心裁地研究了蒙娜丽莎的“生理状况”，认定她患有内斜视，甚至发现她右下脸上有一霰粒肿。而现代派画家达利则坚持认为蒙娜丽莎应是有胡须的。为此他大笔一挥，硬给蒙娜丽莎嘴上添了两撇八字翘须，真是让人哭笑不得。弗洛伊德则将此问题同达芬奇的母亲联系起来。他认为，画家由于离别生母，多年来随父亲与继母生活，难免思念母亲。他从《蒙娜丽莎》模特儿的脸上和嘴唇间发现了他母亲那样的微笑，唤起了他无意识中对母亲的爱。但画家已不能再从那唇上得到亲吻，于是便以高超的画艺把那迷人的美连同他自己的感情全部表现在画布上，那种神秘莫测的微笑由此而诞生。还有人提出了更多的假想，甚至趋于怪诞，却没有一种观点可以完美地解释达芬奇如何创造了蒙娜丽莎的微笑。也许天才画家的思想是难以揣测的，人们在这一伟大的艺术作品前思考着、争论着、也困惑着。而这一微笑，也是美丽动人中有点不可接近……